En biología molecular, una buena elección de tampón y preparación para diferentes pasos de aislamiento de ADN puede ser la diferencia entre pasar a la expresión de proteínas o abrir otro kit de preparación máxima para comenzar de nuevo. A pesar de su importancia crucial, las recetas de búfer a menudo son solo eso: recetas escritas sin explicación o razón de ser de los diferentes componentes. Un tampón de este tipo es el tampón de glucosa tris-EDTA o GTE.
$config[code] not found¿Para qué se utiliza GTE?
El GTE se usa para resuspender los sedimentos de células bacterianas antes de lisar (abrir) las células y recolectar el ADN plasmídico en el interior. La lisozima, que suaviza las membranas celulares, se agrega a menudo junto con el tampón GTE. Lograr una suspensión homogénea de células completas durante este paso para que la solución de lisis agregada posteriormente pueda llegar a todas las células es clave para obtener buenos rendimientos de ADN. GTE está diseñado para hacer esto y, al mismo tiempo, proporciona un entorno estable para el ADN.
Glucosa para la osmolaridad
50 mM (milimolar) de azúcar de glucosa se agrega al tampón GTE para mantener la osmolaridad donde la concentración de soluto fuera de las células es cercana a la de las células. Esto evita la lisis celular prematura, lo que puede causar menores rendimientos de ADN debido a la agregación y degradación. Los otros componentes del tampón también contribuyen a la osmolaridad de la solución, pero la glucosa, al no ser un electrolito, es una buena opción porque no interfiere con las propiedades del tampón de la solución.
Tris para la estabilidad del pH
Tris es el nombre corto de tris (hidroximetil) aminometano, que es un tampón de pH muy común. En el caso del tampón GTE, la sal ácida (Tris-HCl) se agrega al tampón a una concentración de 25 mM. Esto mantiene el pH de la solución en un 8.0 casi fisiológico, un pH ideal para prevenir la hidrólisis ácida (degradación) del ADN plasmídico y reacciones secundarias no deseadas de los otros componentes celulares.
EDTA previene la degradación del ADN
El EDTA, o ácido etilendiaminotetraacético, captura o "quela" los iones metálicos de la solución, evitando que participen en reacciones secundarias no deseadas. En el tampón GTE, se añade EDTA a 10 mM. Su propósito principal es el tampón para redondear el zinc, el magnesio y el calcio libres, evitando así la degradación del ADN por ciertas vías que requieren esos metales.
Algunos consejos importantes
Mantenga su tampón GTE frío y hágalo en pequeñas cantidades para evitar el crecimiento de bacterias no deseadas en él. El azúcar y el pH controlado hacen un gran medio de crecimiento. Siempre use agua purificada. El agua del grifo puede tener un exceso de iones metálicos de las tuberías, lo que puede abrumar la capacidad de captura del EDTA. Si sospecha la presencia de ARN interferente en su muestra, agregue RNasa A a 100 microgramos por mililitro a su tampón GTE para eliminar el problema.
